тип теста пцр качественное что значит
Типы ПЦР анализа
Полимеразная цепная реакция, сокращенно ПЦР.
Представляет собой метод, используемый для экспоненциальной амплификации определенной последовательности ДНК-мишени.
Позволяющей изолировать, секвенировать или клонировать одну РНК среди многих.
ПЦР была разработана более 30 лет назад, американским биохимиком Кэри Муллисом.
Полимеразная реакция имеет широкое использование, применяется не только как анализ на ИППП.
Применение ПЦР практикуется в следующих направлениях: генотипирование:
Как правило, ПЦР представляет собой трехступенчатую реакцию.
Образец, содержащий разбавленную концентрацию матричной ДНК, смешивают с термостабильной ДНК-полимеразой.
Такой как Taq-полимераза, праймер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и магний.
На первой стадии ПЦР образец нагревают до 95-98 градусов.
На втором этапе температуру снижают до приблизительно 55-65 градусов.
На третьей стадии температуру обычно повышают до 72 градусов.
Эта последовательность денатурации, отжига, и расширения повторяется для множества циклов.
Что и приводит к экспоненциальному усилению матричной ДНК.
ПЦР достаточно сложный, но информативный метод исследования.
Зачастую применяется в диагностике патологий вирусной и инфекционной этиологии.
Анализ позволят практически со 100% точностью выявить и определить разновидность патогенного микроорганизма.
В последнее время, полимеразная реакция приобрела популярность в ранней диагностике туберкулеза.
Позволяет выявить возбудителя с 98% точностью на доклинической стадии.
Преимущества диагностики туберкулеза при помощи ПЦР:
Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным микобактериальным патогеном.
Представляет собой одно из самых распространенных и наиболее серьезных инфекционных заболеваний в мире.
Считается, что более 2 миллиардов людей имеют скрытую инфекцию M. Tuberculosis.
Около 8 миллионов — активную форму туберкулеза.
Кроме того, пациенты с ВИЧ и нарушением работы иммунитета на фоне заболевания чаще подвержены дополнительному инфицированию бактерией M. tuberculosis.
В их случае патология протекает сложнее, с многочисленными осложнениями.
ПЦР при подозрении на туберкулез является наиболее востребованным и точным анализом.
Способен выявить заболевание на самых ранних сроках, а также прибегнуть к своевременному, эффективному лечению.
Качественный ПЦР на гепатит С
В большинстве случаев, качественный ПЦР назначается при выявлении в организме пациента антител к гепатиту С.
Полимеразная реакция при подозрении на гепатит С проводится по следующему принципу.
Первое тестирование — на четвертую неделю после обнаружения антител.
Второе — на двенадцатую неделю, третье — на двадцать четвертую.
Далее анализ назначается на постоянной основе, один раз каждые 12 месяцев.
Проведение полимеразной реакции на гепатит Б, А, Ц позволяет получить максимально точные результаты за счет высокой чувствительности теста от 10 до 500 МЕ/мл.
Это дает возможность определять наиболее низкие показатели присутствия в организме вируса и контролировать его дальнейшее развитие.
Расшифровка результатов проводится лечащим врачом.
Положительный анализ говорить о наличии патогенного микроорганизма.
Отрицательный — чаще об отсутствии, но на 100% не исключает НСV.
Взятие анализа на проведение ПЦР НСV проводится в утреннее время, биологическим материалом является венозная кровь.
ПЦР количественный на гепатит С
Количественная полимеразная реакция назначается пациентам, уже имеющим диагноз «гепатит С».
Задача анализа выявить вирусную нагрузку на организм.
Определить количественное присутствие патогена, а также понять, насколько проводимая терапия эффективна.
Расшифровать результаты диагностического исследования поможет лечащей врач-гепатолог.
ПЦР-тест
Методика, преимущества и недостатки анализа
Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости.
Анализ ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания. В его основе лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов РНК и ДНК. Полимеразная цепная реакция была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Он хотел добиться того, чтобы можно было создать множество копий ДНК за счет фермента ДНК-полимеразы, который участвует в ее репликации. За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать. Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике.
Как работает ПЦР
Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование.
«Применяется специальный прибор, он называется амплификатор, в который помещается частица вируса или еще что-нибудь, содержащее РНК или ДНК, – рассказал РИА Новости кандидат медицинских наук, клинический фармаколог Андрей Кондрахин. – Дело в том, что РНК и ДНК достаточно маленькие, чтобы их определить, и понять есть ли в теле человека вредоносные микроорганизмы, поэтому делают ПЦР-тест. В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть». Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Для определения COVID-19 есть отдельный праймер. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание».
Применение ПЦР
ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя. Например, иммунологическими, бактериологическими и микроскопическими исследованиями. Также значительную роль играет фактор времени, потому что анализ делается довольно быстро по сравнению с другими.
«Метод применяется не только для вирусов, но и частичек ДНК, а также бактерий, – пояснил специалист. – Например, мы можем определить, к какому виду бактерия относится, например, к грамотрицательным или грамположительным».
Полимеразную цепную реакцию применяют в криминалистике, когда нужно сделать анализ ДНК с места преступления, его потом сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Также используется для установления отцовства или материнства, нахождения в организме человека вирусов и бактерий, выявления аллергии на некоторые лекарства или их токсичности.
Проведение ПЦР
Для анализа требуется ДНК- или РНК-матрицы, участки которых нужно скопировать, два праймера с необходимыми ферментами, термостабильная ДНК-полимераза, а также некоторые другие компоненты. Метод ПЦР выявляет любую ДНК или РНК живого или мертвого возбудителя. Для их определения используют особые праймеры, в которых содержатся вырожденные позиции РНК или ДНК.
Подготовка материала
Этот этап чрезвычайно важен для проведения анализа ПЦР, потому что большинство ошибок, до 70% случаев, совершается именно во время пробоподготовки, что влияет на конечный результат анализа. Чтобы этого избежать, нужно правильно забрать материал для тестирования и подготовить его. Поэтому во многих лабораториях при заборе крови используются вакуумные системы, которые меньше травмируют человека и не допускают того, чтобы материал для анализа контактировал с окружающей средой или персоналом.
Какие биологические материалы исследуются
В исследовании обычно используются различные биоматериалы:
– Моча. Такой анализ позволяет выявить инфекции мочеполового тракта у мужчин и мочевыделительных органов у женщин.
– Мокрота. Применяется для обнаружения туберкулеза и некоторых других заболеваний легких.
– Биологические жидкости – околоплодная, спинномозговая, суставная и т.д.
– Соскобы со слизистых оболочек, например, носа или ротоглотки. В основном применяется для обнаружения заболеваний, которые передаются половым путем, а также коронавируса.
– Кровь, сыворотка, плазма. Используются для определения вирусов ЦМВ (цитомегаловируса), ВИЧ, гепатитов B, C, D, G, герпеса, а также исследований человеческих генов.
– Биоптаты. Их забирают методом биопсии.
Преимущества и недостатки метода
ПЦР отличается от других исследований тем, что может обнаружить несколько разных возбудителей одновременно. Для него нужно сдать только один анализ, никаких дополнительных тестов не требуется.
«Преимуществом метода является то, что можно определить возбудителя в малом количестве, просто в мизерном, – объяснил клинический фармаколог. – Благодаря этому можно быстрее поставить диагноз, потому что мы знаем, какой именно микроорганизм начинает развиваться. В тесте пишется концентрация выявленных у ДНК и РНК микроорганизмов, если берется мазок из носа или ротовой полости, а также к какому классу они принадлежат. То есть присутствует четкое понимание, к какому типу относится возбудитель и каково его количество. Мало, много, либо его вообще нет в организме».
По словам Андрея Кондрахина, к одному из минусов теста относятся сложности при заборе материала:
«Самый первый недостаток метода – необходима абсолютная чистота в помещении, ближе к стерильности, потому что попадание даже мельчайших инородных объектов может дать неправильный результат из-за того, что чувствительность аппарата очень высокая. Сразу начнется увеличение концентрации этих частиц, которое машина может прочитать. Второе – чтобы пошла реакция, нужны специальные материалы, праймеры. Для каждой реакции есть свои праймеры – кусочки, из которых будут создаваться новые РНК. Тест небыстрый – по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера. Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования».
Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Разновидности ПЦР
ПЦР-тест бывает нескольких видов:
– ПЦР с обратной транскрипцией. Его применяют для амплификации РНК.
– Инвертированная ПЦР используется, если для анализа есть маленький участок последовательности ДНК или РНК.
– Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
– Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции.
– Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров.
Кроме этого, есть асимметричная ПЦР и групп-специфическая ПЦР.
«Существует методика проведения ПЦР в реальном времени, – рассказал Андрей Кондрахин. – Это самый быстрый анализ, как говорится, здесь и сейчас. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус. Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее».
Какие инфекции позволяет выявить
Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить у человека инфекционные заболевания, например:
– уреаплазмоз половых органов;
– наличие раковых клеток;
Также тестирование помогает выявить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям и оценить гормональный фон.
ПЦР-тест на COVID-19
Для ПЦР-теста на коронавирус у человека берется мазок из носа и ротоглотки. Во время пандемии его рекомендуют сдать всем, кто болеет ОРВИ, гриппом, пневмонией и т.д. Берут материал для анализа амбулаторно, также специалист может выехать на дом. Согласно требованиям, пациента выписывают после двух отрицательных тестов на наличие инфекции. ПЦР-тесты могут давать ложноположительный или ложноотрицательный результат, в таком случае необходимо повторное исследование.
Как подготовиться к сдаче анализа
«Специальной подготовки вообще не требуется, разве что не принимать пищу за три часа (минимум) перед забором материала, если будут брать мазок из ротовой полости. Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», – пояснил специалист.
Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами. Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна.
Расшифровка анализа ПЦР
После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками.
«В конце теста машина сообщает, что она нашла в мазке, а врач-лаборант описывает результат, – объяснил эксперт. – Если в программу машины заложена информация о том, при каких количествах считается тест положительным, значит, это будет делать автомат. В анализе будет либо да, либо нет. Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной – это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой. Все равно контроль со стороны врача присутствует».
Насколько точна ПЦР-диагностика инфекций
«ПЦР абсолютно точна, практически 99,9%, потому что аппарат построит абсолютно такую же РНК, как слепок с ключа, один в один. Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», – отметил Андрей Кондрахин.
При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус.
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Новые методы диагностики COVID-19
Поведение нового коронавируса, который вызывает COVID-19, изучают ученые по всему миру. Совершенствуются методы диагностики, направленные на выявление в организме SARS-CoV-2. В конце 2020 года на рынке лабораторных исследований были представлены более 300 разных тестов:
ПЦР и антиген-тесты позволяют обнаруживать частички коронавируса в организме на момент проведения исследования и указывают на то, что человек может быть потенциальным источником заражения окружающих. Серологические тесты на определение антител (иммуноглобулинов) показывают наличие иммунного ответа организма при встрече с вирусом.
ДИЛА одной из первых частных лабораторий Украины начала тестирование на COVID-19 методом ПЦР и имеет уникальный для Украины экспертный опыт, приобретенный на базе 241 184* проведенных тестов!
Одной из последних разработок стали тесты на определение специфических антигенов вируса SARS-CoV-2. У них есть как преимущества, так и недостатки: они более доступны и результат можно получить прямо на месте тестирования в течение 20 минут. Однако чувствительность этих тестов ниже по сравнению с ПЦР, потому как результат теста на АГ, как правило, напрямую зависит от вирусной нагрузки. Антиген-тесты в мазке из носо-, ротоглотки выявляют белки коронавируса SARS-CoV-2, которые синтезируются в ходе репликации и результат также очень зависим от качества и места взятия материала. На сегодня многие компании по всему миру заняты разработкой тестов для выявления антигенов коронавируса SARS-CoV-2. Однако это исследование имеет свои особенности и ограничения применения. Какие именно, расскажут эксперты ДИЛА.
*данные Центра общественного здоровья МОЗУ состоянием на 01.02.2021 г.
В чем заключаются отличия метода ПЦР и антиген-теста
Метод ПЦР – золотой стандарт диагностики, регламентированный Министерством здравоохранения Украины и рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения для установления наличия/отсутствия возбудителя коронавирусной болезни.
ДИЛА предлагает выбор ПЦР исследований в зависимости от необходимости срока получения результата:
Когда показан ПЦР тест:
Современные возможности ПЦР диагностики позволяют ответить на вопрос: присутствует или нет вирус в данном мазке, а также определить вирусную нагрузку (ВН): как много вирусных частиц в 1 мл исследуемого материала (может быть высокая, средняя, низкая). От показателя ВН напрямую зависит контагиозность (заразность) инфицированного человека для окружающих.
Материалом для ПЦР исследования на определение COVID 19 может служить мокрота, смывы с бронхов, кал
Как определяется ВН и ЧТО означает показатель Сt**.
Для условного определения ВН используют показатель «пороговый цикл», обозначенный в результате анализа как Сt (Сycle threshold). Он показывает, сколько циклов амплификации произошло для достижения порога обнаружения вирусной РНК в образце. С каждым циклом количество копий РНК удваивается. Чем больше вирусных частичек в образце, тем быстрее их выявит тест-система и тем ниже будет показатель Ct.
Обычно ПЦР в реальном времени происходит в течение 40 циклов. После каждого цикла оценивают наличия свечения (флюоресценции), которое исходит от меченых фрагментов РНК возбудителя.
Тест для определения антигена SARS-CoV-2 основан на выявлении в биоматериале специфического белка, который принадлежит нуклеокапсиду коронавируса
Для исследования используется материал тот же, что и в большинстве случаев для проведения ПЦР – соскоб из носо- и ротоглотки. Большим плюсом является то, что результат можно получить на месте уже через 20 минут. Также положительным моментом служит его стоимость – экспресс-тесты более доступны, так как для проведения тестирования не требуется дорогостоящее оборудование, квалифицированный персонал, современные лаборатории.
Тест на антиген способен выявить присутствие COVID-19 в том случае, когда вирусная нагрузка высокая, т.е. в носоглотке находятся сотни тысяч и миллионы копий вируса, что чаще бывает в начале заболевания или в период разгара коронавирусной болезни. При средней или низкой вирусной нагрузке тест может дать ложноотрицательный результат.
В основном экспресс тесты предназначены для «быстрого реагирования»:
Положительный результат теста на антиген при наличии симптомов заболевания свидетельствует о том, что человек болен COVID-19. Однако если результат теста положительный, а проявления отсутствуют, необходимо в течение ближайших двух дней провести ПЦР тест для подтверждения полученных результатов теста на антиген.
Отрицательный тест на антиген не исключает наличие COVID-19:
В данном случае для подтверждения антиген-теста используется ПЦР.
Также данный вид тестирования не рекомендуется для проведения лицам с подозрительным и вероятным случаем COVID-19 без клинических проявлений, у которых количество вирусов в носоглотке может быть небольшим и быстрый АГ тест не сможет их выявить.
Отрицательный тест на антиген не является заключением о выздоровлении после коронавирусной болезни, разрешительным документом для досрочного снятия с самоизоляции в сервисе «Дій вдома» в случае прибытия из стран «красной зоны». В этих случаях также требуется результат ПЦР.
Иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) – методика выявления антител (иммуноглобулинов) IgM и IgG к коронавирусу. В ДИЛА проводится определение:
ИХЛА позволяет подтвердить или исключить факт встречи с вирусом SARS-COV-2 и оценить наличие иммунного ответа к нему. Метод направлен на полуколичественное обнаружение антител, которые указывают на то, что человек сейчас болен COVID-19 (IgM) или переболел ранее к SARS-COV-2 (IgG), а также дает возможность оценить иммунный ответ в динамике.
ИХЛА – метод серологической диагностики, обладающий весомыми преимуществами по сравнению с методом ИФА (иммуноферментный анализ):
ИХЛА исследования показаны:
Суммарное определение антител повышает диагностическую ценность исследования и позволяет определить комбинацию иммуноглобулинов в ходе одного исследования, не привязываясь ко времени инфицирования. Также, в ближайшем будущем благодаря исследованию вы сможете:
Иммуноглобулины (антитела) каждого класса появляются, а затем снижаются ниже порога обнаружения в определенный отрезок времени, который зависит от индивидуальных особенностей организма. Например, антитела могут начать вырабатываться гораздо позже, или если антитела класса М уже снизились ниже порога определения, то прибор определит антитела класса G, и наоборот. В таком случае определение суммарных антител имеет значительные преимущества по сравнению с обнаружением IgG и IgM по отдельности за счет большего временного диапазона определения иммунного ответа и позволяет перекрыть «серологические окна», что значительно повышает чувствительность тест-систем.
Как используются тесты для диагностики COVID-19
Разные тесты служат для разных целей
Исследование на антитела lgM позволяет:
Исследование на антитела lgG позволяет:
Они направлены на прямое определение антигена (нуклеокапсидного белка) SARS-CoV-2 иммунохроматографическим методом в образцах соскобов из носоглотки человека, что позволяет с высокой вероятностью предположить инфицирования вирусом (SARS-CoV-2).
Исследование методом ПЦР позволяет:
Диагностический экспресс-тест – скрининговое исследование, оправданное в условиях ограниченной доступности ПЦР, а также когда продолжительность ожидания результата ПЦР-исследования исключает его клиническую эффективность. Он позволяет непосредственно на месте получить качественную оценку касательно заражения. Поэтому экспресс-тесты уместны, если результаты нужно получить максимально быстро у лиц с подозрительным и вероятным случаем COVID-19. Кроме того, исследование методом полимеразной цепной реакции требуется во всех официальных случаях: при выезде за границу, возвращении из стран с высоким уровнем распространением инфекции с целью досрочного прекращения самоизоляции. Во всех этих случаях в качестве подтверждения отсутствия инфекции SARS-CoV-2 рассматриваются исключительно результаты ПЦР.
Быстрый тест на антиген можно сдать в отдельных отделениях, предварительно заполнив Анкету-направление на сайте